LRCH4 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-433102-ACT

Das murine Gen *Lrch4* kodiert LRCH4, ein Protein mit leucinreichen Wiederholungen sowie einer Calponin-Homologie-Domäne, dem eine Funktion als zytoskelettaler Adapter zugeschrieben wird, der Protein-Protein-Interaktionsmodule mit aktinassoziierten Dynamiken verknüpft. Proteine der LRCH-Familie werden mit der Regulation von Zellform, Adhäsion und Motilität in Verbindung gebracht – Prozesse, die das Gewebe-Remodeling und das Verhalten von Immunzellen beeinflussen. In Säugetiersystemen wurde LRCH4 zudem mit Signalnetzwerken der angeborenen Immunität verknüpft, darunter Signalwege, die mit Toll-like-Rezeptor-abhängigen Antworten und inflammatorischen Transkriptionsprogrammen zusammenwirken. Eine veränderte Regulation von LRCH4 wurde daher im Kontext inflammatorischer Phänotypen und einer für krankheitsmodellbezogene Studien relevanten Immundysregulation untersucht.

LRCH4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Lrch4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

LRCH4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Lrch4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Lrch4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen LRCH4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Lrch4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von LRCH4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des LRCH4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Lrch4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.