Plasmide CRISPR d'Activation (h) LLH1: sc-404079-ACT

Le gène humain PLOD1 code la lysyl‑hydroxylase 1 (LLH1), une dioxygénase dépendante du Fe2+ et du 2‑oxoglutarate localisée dans le réticulum endoplasmique (RE), qui hydroxyle des résidus lysine du procollagène — une étape indispensable à la formation de liaisons croisées intermoléculaires stables et à l’assemblage correct de la matrice extracellulaire. En régulant la maturation du collagène, LLH1 influence la mécanique de la matrice, la signalisation cellule–matrice et les processus de remodelage tissulaire qui recoupent des programmes associés à la fibrose et à la réparation des plaies. Une activité altérée de PLOD1 perturbe la fibrillogenèse du collagène et l’organisation de la membrane basale, et a été associée à des phénotypes de fragilité des tissus conjonctifs ainsi qu’à une dérégulation plus large de la matrice observée dans divers contextes pathologiques. Par conséquent, PLOD1/LLH1 est fréquemment étudié dans des travaux portant sur la biosynthèse du collagène, la protéostasie du RE et la modulation, par la MEC, du comportement cellulaire.

LLH1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PLOD1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

LLH1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PLOD1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PLOD1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de LLH1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PLOD1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de LLH1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie LLH1 dans les cellules tumorales présentant une expression de PLOD1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.