Plásmido CRISPR de Activación (h) LIMP II: sc-402532-ACT

SCARB2 codifica la proteína integral de membrana lisosomal 2 (LIMP II), una glucoproteína de membrana tipo III enriquecida en endosomas tardíos y lisosomas que favorece la maduración de los orgánulos, el tráfico de membranas y la homeostasis lisosomal. LIMP II es necesaria para la correcta entrega y función de las hidrolasas lisosomales, incluido su papel bien caracterizado como receptor para el transporte de la glucocerebrosidasa hacia los lisosomas. A través de estas actividades, SCARB2 influye en la dinámica endolisosomal, el flujo de la vía autofagia–lisosoma y las respuestas celulares al estrés proteostático y del metabolismo lipídico. Por ello, la desregulación de SCARB2/LIMP II es relevante para estudios de fenotipos de almacenamiento lisosomal, vías asociadas a la neurodegeneración e interacciones huésped–patógeno que dependen de la entrada endocítica y de la función lisosomal.

LIMP II El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SCARB2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

LIMP II El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SCARB2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SCARB2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de LIMP II. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SCARB2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de LIMP II en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía LIMP II en células tumorales con expresión de SCARB2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.