Plasmide CRISPR d'Activation (h) LIMP II: sc-402532-ACT

SCARB2 code la protéine membranaire intégrale lysosomale 2 (LIMP II), une glycoprotéine transmembranaire de type III enrichie dans les endosomes tardifs et les lysosomes, qui contribue à la maturation des organites, au trafic membranaire et à l’homéostasie lysosomale. LIMP II est nécessaire à l’acheminement et au bon fonctionnement des hydrolases lysosomales, notamment en tant que récepteur bien caractérisé du transport de la glucocérébrosidase vers les lysosomes. Par ces activités, SCARB2 influence la dynamique endolysosomale, le flux de la voie autophagie–lysosome et les réponses cellulaires au stress protéostatique et au stress du métabolisme lipidique. La dérégulation de SCARB2/LIMP II est donc pertinente pour l’étude des phénotypes de surcharge lysosomale, des voies associées à la neurodégénérescence et des interactions hôte–pathogène dépendant de l’entrée endocytaire et de la fonction lysosomale.

LIMP II Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SCARB2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

LIMP II Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SCARB2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SCARB2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de LIMP II. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SCARB2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de LIMP II au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie LIMP II dans les cellules tumorales présentant une expression de SCARB2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.