LGR5 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420320-ACT

Das Mausgen *Lgr5* kodiert den leucinreichen, Wiederholungen enthaltenden G‑Protein‑gekoppelten Rezeptor 5 (LGR5), einen etablierten Marker adulter Stamm- und Vorläuferzellpopulationen in intestinalen Krypten, Haarfollikeln und anderen sich erneuernden Epithelien. LGR5 verstärkt das kanonische Wnt/β‑Catenin‑Signal, indem es R‑Spondine bindet und die Aktivität von RNF43/ZNRF3 moduliert, was die Aufrechterhaltung von Stammzellen, Proliferation und Linienfestlegung unterstützt. Eine veränderte *Lgr5*/LGR5‑Expression wurde mit einer fehlregulierten epithelialen Regeneration und dem Umbau von Geweben in entzündlichen und neoplastischen Kontexten in Verbindung gebracht, wodurch es sich als nützlicher Knotenpunkt zur Untersuchung Wnt‑getriebener Programme eignet. Als mit „Stemness“ assoziierter Rezeptor wird LGR5 häufig verwendet, um klonogenes Potenzial nachzuverfolgen und nischenabhängige Signaldynamiken zu analysieren.

LGR5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Lgr5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

LGR5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Lgr5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Lgr5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen LGR5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Lgr5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von LGR5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des LGR5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Lgr5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.