Plásmido CRISPR de Activación (r) LDH-A: sc-437361-ACT

La lactato deshidrogenasa A (LDH-A) es una oxidorreductasa citosólica que cataliza la interconversión de piruvato y lactato con el reciclaje concomitante de NADH/NAD⁺, lo que sostiene la producción de ATP glucolítico bajo un alto flujo glucolítico. En células de rata, la actividad de LDH-A ayuda a mantener el equilibrio redox y la producción de lactato, influyendo en el flujo de carbono entre la glucólisis y el metabolismo mitocondrial y contribuyendo a las respuestas celulares a la hipoxia y al estrés por nutrientes. El metabolismo del lactato dependiente de LDH-A modula el microambiente metabólico y se cruza con vías que regulan la proliferación, la inflamación y el estrés oxidativo. La expresión o actividad desregulada de LDH-A se estudia con frecuencia como una característica de la remodelación metabólica en biología del cáncer y en modelos de lesión tisular isquémica o inflamatoria.

LDH-A El plásmido de activación CRISPR (r) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

LDH-A El plásmido de activación CRISPR (r) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional , donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de LDH-A. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de LDH-A en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía LDH-A en células tumorales con expresión de silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.