Plasmide CRISPR d'Activation (h) Ku-86: sc-400549-ACT

XRCC5 code pour Ku-86 (Ku80), un composant essentiel de l’hétérodimère Ku70/Ku80 qui reconnaît les cassures double brin de l’ADN et initie la jonction d’extrémités non homologues classique (c-NHEJ). Ku-86 recrute et coordonne DNA-PKcs ainsi que les facteurs de réparation en aval, assurant l’intégration entre la détection des dommages de l’ADN, le traitement des extrémités et la ligation ; il contribue également à la recombinaison V(D)J et au maintien des télomères. Par ces fonctions, XRCC5 influence la stabilité du génome, la signalisation des points de contrôle du cycle cellulaire et les réponses cellulaires au stress génotoxique. La dérégulation de la réparation dépendante de Ku et de l’activité de DNA-PK est fréquemment étudiée dans des contextes d’instabilité chromosomique et d’altération des capacités de réparation de l’ADN observées dans divers modèles pertinents pour les maladies.

Ku-86 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de XRCC5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Ku-86 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus XRCC5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription XRCC5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Ku-86. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus XRCC5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Ku-86 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Ku-86 dans les cellules tumorales présentant une expression de XRCC5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.