Plasmide CRISPR d'Activation (h) KCNQ2: sc-402492-ACT

KCNQ2 code la sous-unité Kv7.2 d’un canal potassique voltage‑dépendant, un composant central des courants potassiques neuronaux de type M (K+) qui stabilisent le potentiel de membrane et limitent les décharges répétitives. En modulant le seuil du potentiel d’action et l’adaptation de la fréquence de décharge, KCNQ2 influence l’excitabilité des circuits corticaux et hippocampiques et s’intègre aux voies de signalisation qui modulent le gating et le trafic du canal, notamment via une régulation dépendante des phosphoinositides à la membrane plasmique. Une altération de la fonction ou de l’expression de KCNQ2 est fortement associée aux troubles du spectre épileptique et à des phénotypes neurodéveloppementaux, ce qui en fait un locus largement utilisé pour étudier la biologie des canaux ioniques, la dynamique des réseaux synaptiques et les relations génotype–phénotype dans des modèles neuronaux humains.

KCNQ2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KCNQ2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

KCNQ2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KCNQ2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KCNQ2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de KCNQ2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KCNQ2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de KCNQ2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie KCNQ2 dans les cellules tumorales présentant une expression de KCNQ2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.