KCC4 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422974-ACT

Slc12a7 kodiert den murinen K+-Cl−-Kotransporter KCC4 (SLC12A7), einen zentralen Regulator der elektroneutralen Chlorid-Extrusion, der zur Festlegung intrazellulärer Cl−-Spiegel, des Zellvolumens und der Ionenhomöostase beiträgt. Durch die Formung von Cl−-Gradienten beeinflusst KCC4 die Membranerregbarkeit und die inhibitorische Signalübertragung und ist zugleich mit osmotischen Stressantworten sowie Programmen der Zytoskelett-Remodellierung verknüpft, die mit Zellmigration und Invasion zusammenhängen. Die KCC4-Aktivität ist zudem an epithelialen Ionentransport sowie an der pH- und Volumenregulation gekoppelt – Prozesse, die die Gewebebarrierefunktion und die Signalgebung in der Mikroumgebung beeinflussen können. Eine fehlregulierte SLC12A7-Expression wurde in krankheitsrelevanten Kontexten mit veränderter Motilität und Remodeling-Phänotypen in Verbindung gebracht, was ihren Einsatz in mechanistischen Studien zu ionentransportabhängigen Zellverhaltensweisen unterstützt.

KCC4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Slc12a7-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

KCC4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Slc12a7-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Slc12a7-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen KCC4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Slc12a7-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von KCC4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des KCC4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Slc12a7-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.