KCC2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402080-ACT

Das humane Gen SLC12A5 kodiert den neuronenspezifischen K+/Cl−-Kotransporter KCC2, einen zentralen Regulator der intrazellulären Chlorid-Homöostase, der Polarität und Wirksamkeit der GABAergen und glycinergen Neurotransmission prägt. Durch die gekoppelte Extrusion von K+ und Cl− unterstützt KCC2 die inhibitorische synaptische Signalübertragung, die neuronale Reifung sowie aktivitätsabhängige Plastizität und ist zudem an zytoskelettalen und Transportprozessen beteiligt, die die Membranlokalisation steuern. Veränderte Expression oder Funktion von KCC2 wird in verschiedenen neuroentwicklungsbedingten und neurologischen Krankheitskontexten mit einer gestörten Balance zwischen Erregung und Hemmung sowie mit Netzwerk-Hyperexzitabilität in Verbindung gebracht. Entsprechend wird SLC12A5 häufig in Signalwegen untersucht, die synaptische Inhibition, neuronale Differenzierung und die Stabilität neuronaler Schaltkreise steuern.

KCC2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC12A5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

KCC2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC12A5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC12A5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen KCC2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC12A5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von KCC2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des KCC2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC12A5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.