ITM2B CRISPR/Cas9 KO Plasmid (h): sc-403561

Übersicht

ITM2B (integrales Membranprotein 2B, auch als BRI2 bekannt) ist ein Typ‑II‑Transmembranprotein, das in sekretorischen Signalwegen sowie im Endomembransystem angereichert ist und dort zum Proteintransport und zur Proteostase beiträgt. ITM2B wird durch Proprotein-Konvertasen prozessiert, wodurch Peptidfragmente entstehen, und wird mit der Modulation amyloidogener Signalwege in Verbindung gebracht – unter anderem über Interaktionen, die die Verarbeitung des Amyloid‑Vorläuferproteins und die extrazelluläre Anreicherung von Peptiden beeinflussen. Zelluläre Studien deuten darauf hin, dass ITM2B an der Dynamik zwischen endoplasmatischem Retikulum und Golgi-Apparat, an der vesikulären Sortierung und an der neuronalen Homöostase beteiligt ist, mit nachgeschalteten Effekten auf synaptische Funktionen und Stressantworten. Genetische Veränderungen von ITM2B sind mit neurodegenerativen Phänotypen assoziiert, darunter die familiäre britische und die familiäre dänische Demenz, was seine Relevanz in Modellen der Amyloidose und neuronalen Vulnerabilität unterstreicht.

ITM2B CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (h) ist ein Pool von Plasmiden, die für die gezielte Disruption des ITM2B-Gens in human-Zelllinien entwickelt wurden. Jedes Plasmid im Pool koexprimiert eine einzigartige sgRNA, die auf eine bestimmte Stelle innerhalb des ITM2B-Lokus abzielt, zusammen mit der Streptococcus pyogenes Cas9-Nuklease, und kodiert für GFP, um die fluoreszente Identifizierung und Anreicherung erfolgreich transfizierter Zellen zu ermöglichen. Diese Multi-Guide-Strategie erhöht die Wahrscheinlichkeit, Frameshifts oder Deletionen zu induzieren, die zu einem funktionellen Knockout führen, und bietet damit eine robustere Alternative zu Single-Guide-Ansätzen. An mehreren Stellen induzierte DSBs werden durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) oder, bei Verwendung mit der enthaltenen HDR-Donor-Matrize, durch homologe Reparatur (HDR) an einer definierten Zielstelle innerhalb des Lokus repariert.

Bei Verwendung in Verbindung mit dem RFP-exprimierenden HDR-Donor können GFP- und RFP-Fluoreszenz gemeinsam genutzt werden, um transfizierte von editierten Zellpopulationen zu unterscheiden, was die auf Durchflusszytometrie basierenden Sortier- und Klonauswahl-Workflows optimiert.

Homology-Directed Repair (HDR)-Donor — Puromycin-Kassette mit RFP-Reporter

Für Anwendungen, die bestätigte, selektierbare Knockout-Klone erfordern, enthält das ITM2B HDR-Plasmid (h) ein HDR-Donorkonstrukt mit einer Puromycin-Resistenzkassette (PuroR) und einem Reporter für rotes fluoreszierendes Protein (RFP), flankiert von Homologiearmen, die für eine definierte ITM2B Zielstelle spezifisch sind.
Bei Co-Transfektion mit dem ITM2B CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (h):

• Die PuroR-RFP-Kassette integriert sich über HDR an der Cas9-Schnittstelle und unterbricht dabei das ITM2B offene Lesegerüst.
  Die RFP-Fluoreszenz liefert einen unmittelbaren visuellen Hinweis auf eine erfolgreiche Integration und ermöglicht die fluoreszenzbasierte Identifizierung oder Sortierung editierter Zellen vor oder parallel zur Puromycin-Selektion.
  Erfolgreich editierte Zellen werden durch Puromycin-Resistenz bestätigt, was den Aufwand für das Klon-Screening erheblich reduziert.
  Diese Selektionsstrategie eignet sich ideal zur Erzeugung stabiler, klonaler KO-Zelllinien für nachgelagerte Funktionsstudien, Wirkstoffscreenings oder die Modellentwicklung.

Cre-lox-Kassetten-Entfernungssystem

Das HDR-Donorkonstrukt verfügt über loxP-Stellen, die die PuroR-RFP-Selektionskassette flankieren, um eine saubere Markerentfernung nach der Klonbestätigung zu ermöglichen. Die transiente Expression der Cre-Rekombinase über das enthaltene Cre-Vektor: sc-418923 schneidet die Kassette heraus, wobei eine minimale Rest-loxP-Stelle innerhalb des ITM2B-Lokus verbleibt und potenzielle Störeffekte auf nachgeschaltete Assays eliminiert werden.
Dieser zweistufige Ansatz:

• Minimiert Störungen der lokalen Chromatinarchitektur und benachbarter regulatorischer Elemente
  Stellt einen nahezu nativen genomischen Kontext am editierten Locus wieder her
  Ermöglicht die Wiederverwendung der Puromycin-Selektionsstrategie in derselben Zelllinie für weitere Editierungen

Hauptmerkmale

• gRNA, die auf ITM2B Exon(e) abzielt, die für die ITM2B Funktion entscheidend sind
  Koexpression von SpCas9 und sgRNA aus einem einzigen Plasmid für eine vereinfachte Verabreichung
  HDR-Donor mit Puromycin-Resistenz für die positive Klonselektion
  loxP-flankierte PuroR-Kassette mit Cre-Rekombinase-Vektor für die nahtlose Markerentfernung
  Wird gebrauchsfertig für die Verabreichung durch Transfektion geliefert

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.