ISG15 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400996-ACT

O ISG15 humano codifica um modificador do tipo ubiquitina induzido por interferon, que é conjugado a proteínas celulares e virais por meio da cascata de ISGuilação, modulando a sinalização da imunidade inata e a proteostase. O ISG15 regula as respostas ao interferon tipo I ao modular vias como a sinalização JAK–STAT e ao influenciar a atividade e a estabilidade de efetores antivirais-chave, além de desempenhar funções adicionais como fator imunomodulador secretado. Por esses mecanismos, o ISG15 afeta as respostas celulares à infecção viral, a estímulos inflamatórios e ao estresse, e sua desregulação tem sido associada a fenótipos de sinalização de interferon aberrante e a mecanismos de doenças relacionadas ao sistema imune. Em pesquisas sobre câncer e doenças infecciosas, o ISG15 é frequentemente estudado como um mediador dependente do contexto de evasão imune, inflamação e programas transcricionais dirigidos por interferon.

ISG15 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ISG15 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ISG15 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ISG15 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ISG15, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ISG15. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ISG15 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ISG15 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ISG15 em células tumorais com expressão de ISG15 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.