IRP-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401817-ACT

Humanes ACO1 kodiert das Eisenregulationsprotein 1 (IRP‑1), einen bifunktionalen zytosolischen Faktor, der – abhängig vom Status seines [4Fe‑4S]-Clusters – zwischen einer enzymatisch aktiven Aconitase-Form und einem RNA-bindenden Regulator wechselt. Als IRP‑1 bindet es an eisenresponsive Elemente (IREs) in Ziel-mRNAs, um Eisenaufnahme, -speicherung und -verwertung zu koordinieren, indem es Translation und mRNA-Stabilität moduliert und so die Biogenese von Eisen-Schwefel-Clustern mit zellulären Redox- und Stoffwechselprogrammen verknüpft. Über dieses posttranskriptionelle Kontrollnetzwerk trägt ACO1 zur Aufrechterhaltung der Eisenhomöostase bei und beeinflusst Signalwege, die mit mitochondrialer Funktion, Antworten auf oxidativen Stress sowie der Assemblierung von Häm- und Eisen-Schwefel-Proteinen zusammenhängen. Eine fehlregulierte IRP‑1/IRE-Signalgebung und eine veränderte ACO1-Aktivität werden häufig im Kontext von Eisenüberladung oder Eisenmangel, anämiebezogener Biologie sowie neurodegenerations- und krebsassoziiertem metabolischem Remodeling untersucht.

IRP-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ACO1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

IRP-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ACO1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ACO1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen IRP-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ACO1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von IRP-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des IRP-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ACO1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.