Plasmide CRISPR d'Activation (h) INPP5E: sc-405923-ACT

INPP5E code l’inositol polyphosphate-5-phosphatase E, une 5‑phosphatase des phosphoinositides qui hydrolyse PI(4,5)P2 et PI(3,4,5)P3 afin de moduler la signalisation lipidique membranaire. La protéine est enrichie au niveau du cil primaire, où elle régule la composition en phosphoinositides du cil, le trafic des récepteurs de signalisation et les voies en aval, notamment Hedgehog ainsi que d’autres modules de signalisation dépendants du cil. Par ces fonctions, INPP5E contribue à la ciliogenèse, au développement neuronal et au maintien de la polarité cellulaire. L’altération ou la dérégulation d’INPP5E a été associée à des ciliopathies humaines, ce qui souligne sa pertinence pour l’étude des mécanismes pathologiques centrés sur le cil.

INPP5E Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de INPP5E sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

INPP5E Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus INPP5E dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription INPP5E, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de INPP5E. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus INPP5E natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de INPP5E au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie INPP5E dans les cellules tumorales présentant une expression de INPP5E silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.