Plásmido CRISPR de Activación (m) IKKβ: sc-421074-ACT

Ikbkb codifica la subunidad beta de la quinasa del inhibidor del factor nuclear kappa B (IKKβ), un componente catalítico central del complejo IKK que fosforila las proteínas IκB para desencadenar la translocación nuclear de NF-κB y la activación de programas transcripcionales. En células de ratón, IKKβ integra señales del receptor de TNF, del receptor de IL-1 y de los receptores de reconocimiento de patrones para coordinar la inmunidad innata, la producción de citocinas inflamatorias, la supervivencia celular y las respuestas al estrés. Esta quinasa también se interconecta con la señalización MAPK y la regulación metabólica mediante el crosstalk con vías vinculadas a la insulina y a mTOR. La señalización IKKβ–NF-κB desregulada se utiliza ampliamente como modelo mecanístico en estudios de inflamación crónica, autoinmunidad, infección y señalización asociada a tumores, sin implicar resultados terapéuticos.

IKKβ El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Ikbkb sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

IKKβ El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Ikbkb en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Ikbkb, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de IKKβ. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Ikbkb y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de IKKβ en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía IKKβ en células tumorales con expresión de Ikbkb silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.