IFN-γ/Interferon gamma Plasmídeo CRISPR/Cas9 KO (h): sc-418061

Visão geral

IFNG codifica o interferão gama (IFN-γ), uma citocina pleiotrópica produzida principalmente por células T ativadas e células NK, que coordena a sinalização do interferão do tipo II. O IFN-γ liga-se ao IFNGR e ativa programas transcricionais dependentes de JAK1/JAK2–STAT1 para promover a ativação de macrófagos, o processamento e a apresentação de antigénios e a polarização Th1, ao mesmo tempo que molda redes de quimiocinas que regulam o tráfego de leucócitos. Este eixo cruza-se com vias de deteção inata e inflamatórias, influenciando a imunidade de barreira e a remodelação tecidular mediada pelo sistema imunitário. A desregulação da sinalização de IFNG está implicada em fenótipos inflamatórios crónicos e autoimunes, na suscetibilidade a doenças infecciosas e na dinâmica do microambiente imunitário tumoral, relevante para a investigação em imunologia e oncologia.

O IFN-γ/Interferon gamma CRISPR/Cas9 KO Plasmid (h) é um conjunto de plasmídeos concebido para a interrupção direcionada do gene IFNG em human linhas celulares. Cada plasmídeo do conjunto coexpressa um sgRNA único, direcionado a um local distinto dentro do locus IFNG, juntamente com a nuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes, e codifica GFP para permitir a identificação fluorescente e o enriquecimento das células transfectadas com sucesso. Esta estratégia multiguia aumenta a probabilidade de induzir deslocamentos de quadro de leitura ou deleções que produzam um knockout funcional, oferecendo uma alternativa mais robusta às abordagens de guia único. As DSBs induzidas em múltiplos locais são resolvidas através da junção de extremidades não homólogas (NHEJ) ou, quando utilizadas com o modelo doador HDR incluído, através da reparação dirigida por homologia (HDR) num local-alvo definido dentro do locus.

Quando utilizado em conjunto com o doador HDR que expressa RFP, a fluorescência de GFP e RFP pode ser utilizada em conjunto para distinguir populações de células transfectadas das editadas, simplificando os fluxos de trabalho de triagem e seleção de clones baseados em citometria de fluxo.

Doador de Reparação Dirigida por Homologia (HDR) — Cassete de Puromicina com Repórter RFP

Para aplicações que requerem clones knockout confirmados e selecionáveis, o IFN-γ/Interferon gamma Plasmídeo HDR (h) inclui uma construção doadora HDR contendo uma cassete de resistência à puromicina (PuroR) e um repórter de proteína fluorescente vermelha (RFP), flanqueados por braços de homologia específicos para um local-alvo definido IFNG.
Quando co-transfectado com o IFN-γ/Interferon gamma Plasmídeo CRISPR/Cas9 KO (h):

• A cassete PuroR-RFP integra-se no local de corte da Cas9 através de HDR, interrompendo o quadro de leitura aberto IFNG.
  A fluorescência da RFP fornece um indicador visual imediato do sucesso da integração, permitindo a identificação ou triagem baseada na fluorescência das células editadas antes ou em paralelo com a seleção por puromicina.
  As células editadas com sucesso são confirmadas através da resistência à puromicina, reduzindo substancialmente a carga de triagem de clones.
  Esta estratégia de seleção é ideal para gerar linhas celulares KO clonais estáveis para estudos funcionais a jusante, triagem de fármacos ou desenvolvimento de modelos.

Sistema de remoção de cassete Cre-lox

A construção doadora HDR apresenta sítios loxP flanqueando a cassete de seleção PuroR-RFP para permitir a remoção limpa do marcador após a confirmação do clone. A expressão transitória da recombinase Cre através do Vetor Cre: sc-418923 incluído excisa a cassete, deixando um local loxP residual mínimo dentro do locus IFNG e eliminando potenciais efeitos de confusão em ensaios a jusante.
Esta abordagem em duas etapas:

• Minimiza a perturbação da arquitetura local da cromatina e dos elementos reguladores vizinhos
  Restaura um contexto genómico quase nativo no locus editado
  Permite a reutilização da estratégia de seleção com puromicina na mesma linha celular para edições adicionais

Características principais

• gRNA direcionado para o(s) exão(ões) IFNG crítico(s) para a função IFN-γ/Interferon gamma
  Coexpressão de SpCas9 e sgRNA a partir de um único plasmídeo para uma entrega simplificada
  Doador HDR com resistência à puromicina para seleção positiva de clones
  Cassete PuroR flanqueada por loxP com vetor de recombinase Cre para remoção contínua do marcador
  Fornecido pronto a usar para entrega por transfecção

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.