HYPE CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406626-ACT

Das humane FICD-Gen kodiert HYPE, ein im endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisiertes Fic-Domänen-Enzym, das die reversible AMPylierung und De-AMPylierung von Proteinsubstraten katalysiert, insbesondere des Chaperons HSPA5/BiP. Durch die Modulation der BiP-Aktivität beeinflusst HYPE die Proteostase im ER, die Signalübertragung der Unfolded Protein Response (UPR) sowie adaptive Stressprogramme, die die Proteinfaltungskapazität und Sekretion mitbestimmen. Diese regulatorische Achse verknüpft FICD mit Signalwegen, die die ER-Homöostase, den Calciumhaushalt und das Zellüberleben unter proteotoxischem Stress steuern. Fehlregulierter ER-Stress und UPR-Signalgebung sind bei Neurodegeneration, Stoffwechselstörungen und krebsrelevanten Phänotypen beteiligt, was FICD/HYPE zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien der Proteostase macht.

HYPE Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FICD-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HYPE Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FICD-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FICD-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HYPE-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FICD-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HYPE-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HYPE-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FICD-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.