Plasmide CRISPR d'Activation (h) HUNK: sc-405786-ACT

HUNK (hormonally upregulated neu-associated kinase) code une sérine/thréonine kinase impliquée dans des programmes de transduction du signal qui influencent le comportement des cellules épithéliales, notamment la prolifération, la différenciation et la survie. Les fonctions rapportées relient HUNK à des voies sensibles aux facteurs de croissance et à des processus d’adaptation au stress pouvant moduler, de manière dépendante du contexte, la polarité cellulaire et des phénotypes migratoires. Une expression ou une activité de HUNK altérée a été observée dans plusieurs modèles liés au cancer, ce qui appuie sa pertinence pour l’étude des mécanismes de signalisation oncogénique et de plasticité cellulaire. En tant que régulateur associé à une activité kinase, HUNK est fréquemment étudiée pour comprendre comment elle reconfigure les réseaux de phosphorylation en aval et les sorties transcriptionnelles dans des systèmes cellulaires humains.

HUNK Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HUNK sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HUNK Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HUNK dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HUNK, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HUNK. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HUNK natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HUNK au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HUNK dans les cellules tumorales présentant une expression de HUNK silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.