Plasmide CRISPR d'Activation (h) H⁺/K⁺ ATPase β: sc-403057-ACT

ATP4B code pour la sous-unité β de l’ATPase gastrique H+/K+, une ATPase de type P hétérodimérique nécessaire à l’assemblage, au ciblage membranaire et à la stabilité fonctionnelle de la pompe à protons dans les cellules pariétales. En soutenant la sécrétion de H+ en échange de K+, ATP4B contribue à l’acidification gastrique, à l’homéostasie ionique épithéliale et aux processus digestifs dépendants du pH. La régulation de l’expression d’ATP4B recoupe des voies impliquées dans la différenciation épithéliale, le trafic membranaire et l’organisation des canalicules sécrétoires. Des altérations de l’expression et la reconnaissance immunitaire des composants de l’ATPase gastrique H+/K+ ont été associées à un dysfonctionnement de la muqueuse gastrique et à des phénotypes de gastrite liée à l’auto-immunité, faisant d’ATP4B un marqueur utile et un nœud mécanistique dans la recherche en biologie de l’estomac.

H+/K+ ATPase β Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATP4B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

H+/K+ ATPase β Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATP4B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATP4B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de H+/K+ ATPase β. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATP4B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de H+/K+ ATPase β au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie H+/K+ ATPase β dans les cellules tumorales présentant une expression de ATP4B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.