Plasmide CRISPR d'Activation (h) hnRNP M: sc-401670-ACT

HNRNPM code la ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène M (hnRNP M), une protéine de liaison à l’ARN qui s’associe aux transcrits naissants pour réguler le traitement du pré-ARNm, l’épissage alternatif et la maturation de l’ARNm. hnRNP M participe au métabolisme de l’ARN lié au spliceosome et influence la sélection des isoformes de transcrits, ce qui peut affecter des programmes d’état cellulaire tels que la prolifération, la différenciation et l’expression génique adaptative au stress. La dérégulation des réseaux d’épissage dépendants de HNRNPM a été associée à des altérations de la transition épithélio-mésenchymateuse ainsi qu’à des signatures aberrantes de traitement de l’ARN observées dans de multiples contextes pathologiques, ce qui en fait un nœud utile pour étudier, au niveau des voies, les conséquences des perturbations de facteurs d’épissage. La modulation expérimentale des niveaux de hnRNP M peut aider à cartographier les événements de basculement d’isoformes, les dépendances d’interactions ARN–protéine et les changements de signalisation en aval induits par le remodelage du transcriptome.

hnRNP M Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HNRNPM sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

hnRNP M Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HNRNPM dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HNRNPM, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de hnRNP M. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HNRNPM natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de hnRNP M au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie hnRNP M dans les cellules tumorales présentant une expression de HNRNPM silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.