Plásmido CRISPR de Activación (m) HMG-1/HMGB1: sc-420871-ACT

Hmgb1 codifica HMG-1/HMGB1, una abundante proteína de cromatina no histónica que se une al ADN y lo curva para regular la dinámica de los nucleosomas, la transcripción, la replicación y la reparación del ADN. En el núcleo, HMGB1 favorece la estabilidad del genoma mediante su participación en las respuestas al daño del ADN e influye en programas de expresión génica vinculados a decisiones sobre el destino celular. Cuando se libera al medio extracelular, HMGB1 actúa como un patrón molecular asociado a daño (DAMP) que modula la señalización inmunitaria innata y las vías inflamatorias, incluidas respuestas mediadas por receptores que involucran TLR y RAGE. La actividad desregulada de HMGB1 se estudia ampliamente en contextos como la inflamación estéril, la autoinmunidad, la neuroinflamación, modelos biológicos de sepsis y la inflamación asociada a tumores en sistemas de ratón.

HMG-1/HMGB1 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Hmgb1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

HMG-1/HMGB1 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Hmgb1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Hmgb1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de HMG-1/HMGB1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Hmgb1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de HMG-1/HMGB1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía HMG-1/HMGB1 en células tumorales con expresión de Hmgb1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.