Plásmido CRISPR de Activación (h) HEM1: sc-407541-ACT

NCKAP1L codifica HEM1, un componente enriquecido en el linaje hematopoyético del complejo regulador WAVE que conecta la señalización de la GTPasa Rac con la polimerización de actina dependiente de Arp2/3. Al coordinar el ensamblaje de actina ramificada, HEM1 sustenta los cambios de morfología de las células inmunitarias necesarios para la migración, la adhesión, la fagocitosis y la formación de la sinapsis inmunológica, integrando señales de las vías de quimiocinas e integrinas. La alteración de NCKAP1L interrumpe la remodelación del citoesqueleto y puede modificar el tráfico y la activación de los leucocitos, por lo que es relevante para estudios sobre desregulación inmunitaria y mecanismos de enfermedad inflamatoria. Dado que la dinámica de la actina también influye en la señalización de receptores y el transporte vesicular, HEM1 se investiga con frecuencia en vías que regulan la motilidad celular, la polaridad y la endocitosis en contextos hematopoyéticos.

HEM1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de NCKAP1L sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

HEM1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus NCKAP1L en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional NCKAP1L, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de HEM1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo NCKAP1L y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de HEM1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía HEM1 en células tumorales con expresión de NCKAP1L silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.