Hck CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401507-ACT

Das humane HCK-Gen kodiert Hck, eine nichtrezeptorische Tyrosinkinase der Src-Familie, die überwiegend in myeloischen Zelllinien exprimiert wird und dort Signale von Immunrezeptoren und Integrinen mit nachgeschalteten Phosphorylierungskaskaden koppelt. Hck reguliert über Signalwege, die sich mit der PI3K–AKT-, MAPK/ERK- und STAT-Signalisierung überschneiden, die Umgestaltung des Zytoskeletts, Adhäsion, Chemotaxis, Phagozytose sowie die Produktion entzündlicher Mediatoren. In hämatopoetischen und immunologischen Kontexten wird eine fehlregulierte Hck-Aktivität mit veränderten angeborenen Immunantworten und aberranten Signalnetzwerken in Leukämien und anderen entzündungsassoziierten Pathologien in Verbindung gebracht. Als proximale Kinase in rezeptorgetriebener Signalübertragung wird HCK häufig untersucht, um stimulusabhängige Phosphorylierungsprogramme und die Rückkopplungskontrolle in myeloischen Zellen zu analysieren.

Hck Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HCK-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Hck Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HCK-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HCK-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Hck-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HCK-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Hck-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Hck-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HCK-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.