Plasmide CRISPR d'Activation (h) HADHA: sc-402803-ACT

HADHA code la sous-unité alpha de la protéine mitochondriale trifonctionnelle, un complexe multi-enzymatique indispensable à la β‑oxydation des acides gras à longue chaîne. HADHA apporte les activités d’hydratase de l’énoyl‑CoA et de déshydrogénase du 3‑hydroxyacyl‑CoA, qui soutiennent la production d’énergie mitochondriale et le catabolisme des lipides, reliant le flux d’acides gras à l’équilibre rédox et à l’homéostasie métabolique. Une altération de la fonction de HADHA est associée à des défauts de l’oxydation mitochondriale des acides gras et à un stress cellulaire lié aux lipides, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude du remodelage métabolique et du dysfonctionnement mitochondrial. Comme l’oxydation des acides gras s’entrecroise avec les réponses au stress oxydant et le contrôle qualité des organites, HADHA est souvent étudié dans les voies qui régissent la forme fonctionnelle des mitochondries et la signalisation induite par les lipides.

HADHA Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HADHA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HADHA Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HADHA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HADHA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HADHA. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HADHA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HADHA au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HADHA dans les cellules tumorales présentant une expression de HADHA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.