Plásmido CRISPR de Activación (h) G_{α z}: sc-402241-ACT

GNAZ codifica la subunidad alfa Gαz de una proteína G heterotrimérica inhibidora, un mediador de señalización de la familia Gi/o que acopla determinados receptores acoplados a proteína G (GPCR) a la supresión de la adenilil ciclasa y a la reducción del AMPc intracelular. Mediante la regulación de la dinámica de segundos mensajeros, Gαz influye en la señalización aguas abajo mediada por PKA, la modulación de canales iónicos y programas de fosforilación que modelan la excitabilidad neuronal, la secreción y la desensibilización de receptores. La actividad de GNAZ se entrecruza con vías sensibles a neurotransmisores y hormonas, y se ha implicado una alteración del acoplamiento GPCR–proteína G en fenotipos neuropsiquiátricos, la función plaquetaria y anomalas en la señalización endocrina. Como subunidad Gα inhibidora distinta e insensible a PTX, Gαz constituye un nodo útil para diseccionar la señalización inhibidora específica de receptores en comparación con otras proteínas Gi.

Gα z El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de GNAZ sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Gα z El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus GNAZ en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional GNAZ, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Gα z. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo GNAZ y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Gα z en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Gα z en células tumorales con expresión de GNAZ silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.