GPR30 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402502-ACT

GPER1 kodiert GPR30 (GPER), einen membranassoziierten Östrogenrezeptor, der schnelle, nichtgenomische Östrogensignale vermittelt und mit kanonischen, östrogenresponsiven Transkriptionsprogrammen verknüpft ist. Die Aktivierung von GPR30 kann cAMP/PKA, EGFR-Transaktivierung, MAPK/ERK, PI3K/AKT sowie intrazelluläre Ca²⁺-Flüsse auslösen und beeinflusst – abhängig vom Zelltyp – Proliferation, Migration, Stoffwechsel und inflammatorische Signalwege. Eine Fehlregulation der GPER1/GPR30-Signalgebung wurde mit hormonabhängigen Krebserkrankungen, kardiovaskulären und metabolischen Funktionsstörungen sowie neuroinflammatorischen Prozessen in Verbindung gebracht, was den Rezeptor zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Analyse östrogengetriebener Signalweg-Interaktionen macht. Als biomarkergekoppelter Signalrezeptor wird GPR30 häufig im Hinblick auf seine Auswirkungen auf Zellzustandsübergänge, Rezeptor-Trafficking und Stressantwort-Genetzwerke untersucht.

GPR30 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GPER1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GPR30 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GPER1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GPER1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GPR30-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GPER1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GPR30-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GPR30-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GPER1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.