Plasmide CRISPR d'Activation (h) GPR171: sc-412047-ACT

GPR171 code un récepteur orphelin de classe A couplé aux protéines G, enrichi dans le système nerveux central et impliqué dans la signalisation neuromodulatrice. En tant que GPCR, il devrait se coupler à des protéines G hétérotrimériques afin d’influencer des voies de seconds messagers telles que la signalisation cAMP/PKA et MAPK, modulant ainsi l’excitabilité neuronale et la transmission synaptique. Des associations rapportées relient une signalisation GPR171 altérée à des phénotypes neurocomportementaux et à des voies pertinentes pour la récompense, la réactivité au stress et le comportement alimentaire. Ces caractéristiques font de GPR171 une cible utile pour étudier la régulation des GPCR, le trafic des récepteurs et les programmes transcriptionnels en aval dans des contextes neuronaux et neuroendocriniens.

GPR171 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GPR171 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GPR171 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GPR171 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GPR171, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GPR171. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GPR171 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GPR171 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GPR171 dans les cellules tumorales présentant une expression de GPR171 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.