Plasmide CRISPR d'Activation (h) GPR105: sc-405954-ACT

P2RY14 code pour le récepteur purinergique humain GPR105, un RCPG qui répond aux UDP-sucres extracellulaires tels que l’UDP-glucose et se couple à la signalisation Gi/o afin de moduler l’AMPc intracellulaire et les programmes inflammatoires en aval. L’activité de GPR105 influence la chimiotaxie des leucocytes et la production de cytokines, reliant la détection des sucres nucléotidiques à la régulation de l’immunité innée dans les compartiments myéloïdes et épithéliaux. Ce récepteur s’inscrit à l’interface de réseaux de signalisation chimiokinique et purinergique qui façonnent l’inflammation tissulaire et les réponses de barrière. Une signalisation P2RY14/GPR105 altérée a été associée à une dysrégulation immunitaire et à une physiopathologie liée à l’inflammation, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques des processus pathologiques induits par le microenvironnement.

GPR105 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de P2RY14 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GPR105 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus P2RY14 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription P2RY14, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GPR105. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus P2RY14 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GPR105 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GPR105 dans les cellules tumorales présentant une expression de P2RY14 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.