Plasmide CRISPR d'Activation (h) GPAM: sc-403961-ACT

La GPAM humaine (glycérol-3-phosphate acyltransférase, mitochondriale) catalyse l’étape initiale et limitante de la synthèse de novo des glycérolipides en convertissant le glycérol-3-phosphate et des acyl-CoA à longue chaîne en acide lysophosphatidique. Cette activité enzymatique relie la gestion mitochondriale des lipides à la production d’acide phosphatidique, à l’assemblage des triacylglycérols et à un remodelage plus large des phospholipides, influençant ainsi la biogenèse des membranes et la formation des gouttelettes lipidiques. GPAM agit à l’interface entre l’utilisation des acides gras et l’homéostasie énergétique, avec des répercussions en aval sur les lipides de signalisation et l’équilibre des réseaux métaboliques. Des altérations de l’expression ou de l’activité de GPAM ont été associées à des phénotypes de dérégulation du métabolisme lipidique pertinents pour la stéatose hépatique, la résistance à l’insuline et les voies de risque cardiométabolique, ce qui en fait un nœud utile pour des études mécanistiques en biologie métabolique.

GPAM Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GPAM sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GPAM Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GPAM dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GPAM, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GPAM. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GPAM natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GPAM au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GPAM dans les cellules tumorales présentant une expression de GPAM silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.