Plásmido CRISPR de Activación (h) GnT-I: sc-409648-ACT

MGAT1 codifica la N-acetilglucosaminiltransferasa I (GnT-I), una enzima del Golgi medial que cataliza el primer paso comprometido en la conversión de N-glicanos ricos en manosa a N-glicanos complejos e híbridos. Al iniciar la ramificación en la glicosilación N‑ligada, GnT-I influye en el plegamiento y la estabilidad de las proteínas, el tráfico de receptores y las interacciones célula–célula y célula–matriz en proteínas secretadas y de membrana. La remodelación de glicanos dependiente de MGAT1 se integra con las vías de procesamiento del Golgi y modula las salidas de señalización de glicoproteínas implicadas en la adhesión y la respuesta a factores de crecimiento. La actividad desregulada de MGAT1 y las estructuras alteradas de N‑glicanos se estudian con frecuencia en el contexto de la biología del cáncer, la regulación inmunitaria y los trastornos congénitos de la glicosilación como contribuyentes mecanísticos a fenotipos celulares aberrantes.

GnT-I El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de MGAT1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

GnT-I El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus MGAT1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional MGAT1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de GnT-I. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo MGAT1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de GnT-I en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía GnT-I en células tumorales con expresión de MGAT1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.