Plasmide CRISPR d'Activation (h) GlyR α4: sc-416048-ACT

GLRA4 code pour la sous-unité alpha 4 du récepteur à la glycine (GlyR α4), un sous-unité de canal chlorure ligand-dépendant qui contribue à la neurotransmission inhibitrice rapide dans le système nerveux central en médiant une hyperpolarisation dépendante de la glycine. Les complexes GlyR régulent l’excitabilité neuronale et la synchronisation des réseaux via la conductance au chlorure et des interactions avec d’autres voies inhibitrices, notamment la signalisation GABAergique. Bien que GLRA4 soit moins bien caractérisé que d’autres membres de la famille GLRA, la biologie des récepteurs glycinergiques est largement associée au contrôle moteur, aux circuits de sursaut (startle) et à l’équilibre de l’inhibition synaptique, des processus fréquemment impliqués dans des phénotypes neurodéveloppementaux et neuropsychiatriques. L’étude de GLRA4 soutient des travaux mécanistiques sur l’assemblage des récepteurs, la fonction synaptique et les altérations de la signalisation inhibitrice pertinentes pour les troubles du système nerveux, sans présumer d’issues cliniques.

GlyR α4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GLRA4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GlyR α4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GLRA4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GLRA4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GlyR α4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GLRA4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GlyR α4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GlyR α4 dans les cellules tumorales présentant une expression de GLRA4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.