Plasmide CRISPR d'Activation (h) GFAT1: sc-403022-ACT

Le gène humain **GFPT1** code la glutamine—fructose-6-phosphate amidotransférase 1 (GFAT1), enzyme limitante de la voie de biosynthèse des hexosamines, qui convertit le fructose-6-phosphate et la glutamine en glucosamine-6-phosphate, contrôlant ainsi les réserves cellulaires d’UDP-GlcNAc. En régulant la disponibilité des substrats pour les glycosylations liées à l’azote (N) et à l’oxygène (O), GFAT1 influence la protéostasie, le trafic membranaire et des programmes de signalisation sensibles à l’état nutritionnel. L’activité de GFPT1 relie le métabolisme du glucose et des acides aminés à des voies d’adaptation au stress, notamment l’homéostasie du réticulum endoplasmique (RE) et l’équilibre redox, et module les dynamiques transcriptionnelles et cytosquelettiques dépendantes de l’O‑GlcNAcylation. Une altération de la fonction de GFPT1 a été associée à des syndromes myasthéniques congénitaux et a été étudiée dans le contexte du remodelage métabolique et des modifications de glycosylation observés dans divers états cellulaires pertinents pour les maladies.

GFAT1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GFPT1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GFAT1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GFPT1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GFPT1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GFAT1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GFPT1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GFAT1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GFAT1 dans les cellules tumorales présentant une expression de GFPT1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.