GCKR CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401623-ACT

Das menschliche GCKR kodiert das Glukokinase-Regulatorprotein, einen in Hepatozyten angereicherten Modulator der Glukoseverwertung, der Glukokinase bindet und sequestriert, um den glykolytischen Fluss in Abhängigkeit vom Nährstoff- und Phosphatstatus feinzujustieren. Durch die Regulation der Verfügbarkeit von Glukokinase beeinflusst GCKR die hepatische Glukosesensorik, die Glykogensynthese sowie das Gleichgewicht zwischen Glykolyse und de-novo-Lipogenese und verknüpft damit den Kohlenhydratstoffwechsel mit der Triglyzeridproduktion. Genetische Variation oder eine veränderte Expression von GCKR wurde mit Verschiebungen des Nüchternblutzuckers, der Insulinsensitivität und zirkulierender Lipidmerkmale in Verbindung gebracht, was GCKR für die Biologie metabolischer Erkrankungen relevant macht. In zellbasierten Modellen bietet die Perturbation von GCKR eine gut handhabbare Möglichkeit, die Verschaltung hepatischer Stoffwechselwege und nährstoffresponsive Transkriptionsprogramme zu untersuchen.

GCKR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GCKR-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GCKR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GCKR-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GCKR-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GCKR-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GCKR-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GCKR-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GCKR-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GCKR-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.