GCKR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401623-ACT

Il gene umano **GCKR** codifica la proteina regolatrice della glucokinasi, un modulatore dell’utilizzo del glucosio arricchito negli epatociti che si lega alla glucokinasi e la sequestra, regolando il flusso glicolitico in risposta allo stato nutrizionale e ai livelli di fosfati. Regolando la disponibilità della glucokinasi, GCKR influenza il sensing epatico del glucosio, la sintesi di glicogeno e l’equilibrio tra glicolisi e lipogenesi de novo, integrando il metabolismo dei carboidrati con la produzione di trigliceridi. La variabilità genetica o un’alterata espressione di GCKR sono state associate a cambiamenti della glicemia a digiuno, della sensibilità all’insulina e dei tratti lipidici circolanti, rendendolo rilevante per la biologia delle malattie metaboliche. Nei modelli cellulari, la perturbazione di GCKR offre un modo gestibile per interrogare l’architettura delle vie metaboliche epatiche e i programmi trascrizionali responsivi ai nutrienti.

GCKR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GCKR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GCKR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GCKR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GCKR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GCKR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GCKR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GCKR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GCKR nelle cellule tumorali con espressione di GCKR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.