GC-C CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403413-ACT

Das humane Gen **GUCY2C** kodiert die Guanylatcyclase-C (GC-C), einen apikal lokalisierten Membranrezeptor und eine partikuläre Guanylylcyclase, die im Darmepithel als Antwort auf endogene Guanylin-Peptide und Enterotoxine die Bildung von cGMP katalysiert. Die durch GC-C ausgelöste cGMP-Signalübertragung reguliert über nachgeschaltete Effektoren wie PKG und zyklische Nukleotid–gesteuerte Signalwege die CFTR-abhängige Chlorid- und Bikarbonatsekretion, den epithelialen Flüssigkeitshaushalt, die Barrierefunktion sowie Programme der Proliferation und Differenzierung. Diese Signalachse ist in die intestinale Homöostase und Entzündungsantworten eingebunden; eine veränderte GUCY2C-Expression oder -Signalgebung wurde mit gastrointestinaler Pathophysiologie und tumorassoziierten epithelialen Zuständen in Verbindung gebracht. Als Membranrezeptor mit kontextabhängiger transkriptioneller Regulation wird GC-C häufig in Studien zur epithelialen Signalübertragung, mukosalen Immunologie und zum Crosstalk onkogener Signalwege untersucht.

GC-C Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GUCY2C-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GC-C Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GUCY2C-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GUCY2C-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GC-C-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GUCY2C-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GC-C-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GC-C-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GUCY2C-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.