Plasmide CRISPR d'Activation (h) GAPDH: sc-400163-ACT

Le gène humain **GAPDHS** code une isoforme de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase spécifique des spermatozoïdes (famille GAPDH) qui catalyse une étape clé de la glycolyse, en convertissant le glycéraldéhyde-3-phosphate en 1,3-bisphosphoglycérate, avec production concomitante de NADH. **GAPDHS** est fortement exprimé dans les cellules germinales mâles et soutient le métabolisme énergétique requis pour la maturation et la motilité des spermatozoïdes, ce qui le relie au flux glycolytique, à l’équilibre rédox et à la production d’ATP dans le flagelle. Une dérégulation ou des variations génétiques de **GAPDHS** ont été associées à une altération de la fonction spermatique et à des phénotypes liés à l’infertilité, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de la biologie de la reproduction, de la compartimentation métabolique et de la coordination mitochondrie–glycolyse. En tant qu’enzyme de la famille GAPDH, il constitue également un nœud utile pour examiner comment les enzymes glycolytiques contribuent à des programmes cellulaires spécialisés au-delà du métabolisme d’entretien.

GAPDH-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GAPDHS sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GAPDH-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GAPDHS dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GAPDHS, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GAPDH-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GAPDHS natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GAPDH-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GAPDH-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de GAPDHS silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.