GAPDH Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400163-ACT

O GAPDHS humano codifica uma isoforma de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase específica de espermatozoides (família GAPDH) que catalisa uma etapa-chave da glicólise, convertendo gliceraldeído-3-fosfato em 1,3-bisfosfoglicerato com produção concomitante de NADH. O GAPDHS é altamente expresso em células germinativas masculinas e sustenta o metabolismo energético necessário para a maturação e a motilidade dos espermatozoides, relacionando-se ao fluxo glicolítico, ao equilíbrio redox e à geração de ATP no flagelo. A desregulação ou variação genética em GAPDHS tem sido associada a função espermática prejudicada e fenótipos ligados à infertilidade, tornando-o relevante para estudos de biologia reprodutiva, compartimentalização metabólica e coordenação mitocondrial–glicolítica. Como enzima da família GAPDH, também serve como um ponto útil para investigar como enzimas glicolíticas contribuem para programas celulares especializados além do metabolismo de manutenção.

GAPDH-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GAPDHS sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GAPDH-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GAPDHS em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GAPDHS, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GAPDH-2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GAPDHS nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GAPDH-2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GAPDH-2 em células tumorais com expressão de GAPDHS silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.