GAD-65 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402137-ACT

GAD2 kodiert die Glutamatdecarboxylase 65 (GAD-65), ein pyridoxalphosphatabhängiges Enzym, das die Decarboxylierung von Glutamat zu γ‑Aminobuttersäure (GABA) katalysiert, einem der wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter im menschlichen Zentralnervensystem. GAD-65 ist an präsynaptischen Endigungen angereichert, wo es die aktivitätsabhängige GABA-Synthese unterstützt und zum Recycling synaptischer Vesikel sowie zur Homöostase inhibitorischer Schaltkreise beiträgt. Durch die Regulation des Gleichgewichts zwischen Erregung und Hemmung beeinflusst GAD2 neuronale Signalnetzwerke, die an der Neuroentwicklung, der synaptischen Plastizität und stressresponsiven Schaltkreisen beteiligt sind. Veränderungen der GAD-65-Expression oder -Funktion wurden im Zusammenhang mit neurologischen und neuropsychiatrischen Phänotypen untersucht, die mit einer gestörten GABAergen Neurotransmission einhergehen, darunter Anfallsanfälligkeit und Funktionsstörungen inhibitorischer Interneurone.

GAD-65 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GAD2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GAD-65 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GAD2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GAD2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GAD-65-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GAD2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GAD-65-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GAD-65-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GAD2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.