Plasmide CRISPR d'Activation (m) G9a: sc-430994-ACT

Chez la souris, Ehmt2 code la méthyltransférase de lysine G9a, l’un des principaux enzymes responsables de la mono‑ et de la diméthylation de H3K9, qui met en place une chromatine répressive et stabilise des programmes transcriptionnels spécifiques de lignée. G9a coopère avec d’autres régulateurs épigénétiques pour contrôler la formation de l’hétérochromatine, le dialogue avec la méthylation de l’ADN et le silençage transcriptionnel au cours du développement, de la régulation immunitaire et de la différenciation neuronale. Par ces mécanismes fondés sur la chromatine, Ehmt2 influence la progression du cycle cellulaire, la stabilité du génome et les réseaux d’expression génique sensibles au stress. Une activité de G9a dérégulée et des profils altérés de méthylation de H3K9 sont fréquemment exploités dans des modèles de maladie (cancer, troubles neurodéveloppementaux et pathologies inflammatoires) afin d’étudier les déterminants épigénétiques d’une expression génique aberrante.

G9a Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ehmt2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

G9a Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ehmt2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ehmt2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de G9a. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ehmt2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de G9a au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie G9a dans les cellules tumorales présentant une expression de Ehmt2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.