Plasmide CRISPR d'Activation (h) fractalkine: sc-402339-ACT

CX3CL1 code la fractalkine, une chimiokine CX3C unique qui existe à la fois sous forme de molécule d’adhérence ancrée à la membrane et sous forme de chémioattractant soluble. Via son récepteur CX3CR1, la fractalkine régule l’adhérence des leucocytes, la chimiotaxie et la communication microglie–neurone, reliant la signalisation des chimiokines au trafic inflammatoire et à la surveillance des tissus. L’activité CX3CL1–CX3CR1 recoupe des programmes inflammatoires pilotés par NF-κB et module l’activation endothéliale ainsi que le recrutement des cellules immunitaires. Une signalisation de la fractalkine dérégulée a été associée à la neuroinflammation, à l’inflammation vasculaire et aux interactions tumeur–immunité, faisant de CX3CL1 un nœud d’intérêt pour l’étude du dialogue immunité–stroma et de la pathobiologie inflammatoire.

fractalkine Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CX3CL1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

fractalkine Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CX3CL1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CX3CL1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de fractalkine. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CX3CL1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de fractalkine au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie fractalkine dans les cellules tumorales présentant une expression de CX3CL1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.