FOXD1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402521-ACT

FOXD1 (forkhead box D1) ist ein Transkriptionsfaktor der Forkhead-Familie, der während der embryonalen Entwicklung Programme der Zellschicksalsfestlegung, Proliferation und Differenzierung reguliert und dabei insbesondere bei der Nierenmorphogenese sowie der Musterung stromaler Zelllinien eine wichtige Rolle spielt. Durch die Bindung an Forkhead-DNA-Motive koordiniert FOXD1 transkriptionelle Netzwerke, die mit entwicklungsbiologischen Signalwegen wie WNT, TGF-β sowie wachstumsfaktorgetriebener MAPK/PI3K-Signalübertragung zusammenlaufen, um die Gewebearchitektur zu formen. Eine fehlregulierte FOXD1-Expression wurde in mehreren Krebskontexten mit veränderten Epithel–Stroma-Interaktionen, Umbau der extrazellulären Matrix und invasiven zellulären Phänotypen in Verbindung gebracht, was FOXD1 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung der transkriptionellen Kontrolle tumor-mikroumgebungsbezogener Programme macht. Darüber hinaus sind FOXD1-assoziierte genregulatorische Schaltkreise relevant für die Erforschung von Entwicklungsstörungen und linienspezifischen transkriptionellen Zuständen in humanen Zellen.

FOXD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FOXD1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FOXD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FOXD1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FOXD1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FOXD1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FOXD1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FOXD1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FOXD1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FOXD1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.