FKRP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404396-ACT

FKRP kodiert das Fukutin-verwandte Protein, eine im Golgi-Apparat lokalisierte Glykosyltransferase, die für die posttranslationale Modifikation von α‑Dystroglykan erforderlich ist – einem Schlüsselrezeptor, der die extrazelluläre Matrix mit dem Dystrophin‑Glykoprotein‑Komplex verbindet. Über seine Rolle in der O‑Mannosyl‑Glykosylierung trägt FKRP zur Integrität der Basalmembran und zur Stabilität des Sarkolemms bei und beeinflusst damit den Erhalt von Muskelfasern sowie die Organisation neuromuskulären Gewebes. Eine Störung der FKRP‑abhängigen Glykosylierung beeinträchtigt die Ligandenbindung von α‑Dystroglykan und ist stark mit Dystroglykanopathie‑Phänotypen assoziiert, darunter Gliedergürtel‑Muskeldystrophie und Subtypen der kongenitalen Muskeldystrophie. Als Knotenpunkt, der die Glykosylierungsmaschinerie mit der Signalübertragung der extrazellulären Matrix verknüpft, wird FKRP in Modellen der Muskelpathologie und des matrixabhängigen Zellverhaltens umfassend untersucht.

FKRP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FKRP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FKRP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FKRP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FKRP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FKRP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FKRP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FKRP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FKRP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FKRP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.