Plasmide CRISPR d'Activation (h) Fibrocystin: sc-403635-ACT

PKHD1 code la fibrocystine/polyductine, une grande protéine associée à la membrane, fortement enrichie au niveau des cils primaires et des corps basaux des cellules épithéliales rénales et biliaires, où elle contribue à la ciliogenèse, à la signalisation mécanosensorielle et au maintien de la polarité épithéliale. La fibrocystine participe à des voies liées aux cils qui coordonnent la signalisation dépendante du calcium, la polarité planaire cellulaire et la tubulogenèse lors du développement des canaux et des néphrons. Une perturbation ou une expression altérée de PKHD1 est fortement associée à des phénotypes fibrokystiques hépatorénaux, notamment la polykystose rénale autosomique récessive, traduisant des défauts de signalisation ciliaire et de morphogenèse ductale. La modulation expérimentale des niveaux de fibrocystine est donc pertinente pour étudier la différenciation épithéliale dépendante des cils, la formation de la lumière et les réponses au stress dans des systèmes modèles du rein et du foie.

Fibrocystin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PKHD1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Fibrocystin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PKHD1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PKHD1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Fibrocystin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PKHD1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Fibrocystin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Fibrocystin dans les cellules tumorales présentant une expression de PKHD1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.