Plasmide CRISPR d'Activation (h) Fibrinogen α: sc-400793-ACT

FGA code la chaîne α du fibrinogène, un composant central de l’hexamère de fibrinogène plasmatique qui est converti par protéolyse par la thrombine en fibrine lors de la coagulation. Au-delà de la formation du caillot, la fibrine/le fibrinogène intervient dans l’agrégation plaquettaire, l’adhésion médiée par les intégrines et le remodelage de la matrice extracellulaire, reliant l’hémostase à l’inflammation et à la réparation tissulaire. La régulation de l’expression de FGA dans les hépatocytes et en contexte de phase aiguë influence les taux circulants de fibrinogène ainsi que la signalisation en aval dans les voies thrombine/PAR et fibrinolytiques. Une production ou une maturation du fibrinogène dérégulée est associée à des troubles héréditaires du fibrinogène et contribue à des phénotypes thrombotique et inflammatoire pertinents pour la recherche en biologie cardiovasculaire et hépatique.

Fibrinogen α Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FGA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Fibrinogen α Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FGA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FGA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Fibrinogen α. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FGA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Fibrinogen α au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Fibrinogen α dans les cellules tumorales présentant une expression de FGA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.