Plasmide CRISPR d'Activation (h) FBXO30: sc-402735-ACT

FBXO30 code une protéine à domaine F-box qui sert de composant de reconnaissance des substrats des complexes de ligase E3 ubiquitine de type SCF (SKP1–CUL1–F-box), en reliant les protéines cibles à leur dégradation protéasomale dépendante de l’ubiquitine. Par ce rôle, FBXO30 contribue à la régulation de l’homéostasie protéique, de la progression du cycle cellulaire et de la signalisation en réponse au stress, en modulant la stabilité d’effecteurs clés des voies de signalisation. Une activité altérée du système ubiquitine–protéasome est largement associée à la signalisation oncogénique, aux états inflammatoires et aux phénotypes dégénératifs, ce qui rend l’expression et la fonction de FBXO30 pertinentes pour des études mécanistiques dans ces contextes. Dans des modèles cellulaires humains, la modulation de FBXO30 offre un moyen d’interroger les réseaux de protéostasie ainsi que les conséquences transcriptionnelles et phénotypiques en aval.

FBXO30 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FBXO30 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

FBXO30 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FBXO30 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FBXO30, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de FBXO30. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FBXO30 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de FBXO30 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie FBXO30 dans les cellules tumorales présentant une expression de FBXO30 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.