FADD CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400580-ACT

Humanes FADD (Fas-assoziiertes Protein mit Death Domain) ist ein Adaptermolekül, das Signale von Todesrezeptoren, darunter FAS- und TNFRSF-Mitglieder, weiterleitet, um die extrinsische Apoptose einzuleiten. Indem FADD Rezeptorkomplexe über homotypische Death-Domain-Interaktionen mit Initiatorcaspasen wie CASP8 verbindet, reguliert es die Aktivierung der Caspase-Kaskade, den programmierten Zelltod und die Immunhomöostase. Über die Apoptose hinaus beeinflusst FADD kontextabhängig auch die NF-κB-Signalübertragung, Entzündungsreaktionen und die Kontrolle des Zellzyklus. Eine fehlregulierte FADD-Signalgebung wird mit einer veränderten Apoptosekompetenz und Immundysregulation in Verbindung gebracht, wie sie in vielfältigen Krebs- und entzündlichen Krankheitsmodellen beobachtet wird.

FADD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FADD-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FADD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FADD-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FADD-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FADD-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FADD-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FADD-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FADD-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FADD-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.