Plasmide CRISPR d'Activation (h) ETEA: sc-403730-ACT

FAF2 code la protéine ETEA, résidente du réticulum endoplasmique (également connue sous le nom d’UBXD8), un adaptateur à domaine UBX qui relie des substrats ubiquitinylés à l’ATPase p97/VCP afin de soutenir la dégradation associée au RE (ERAD) et la protéostasie. En coordonnant l’extraction et le renouvellement de protéines du RE mal conformées ou régulées, ETEA contribue au couplage avec la réponse aux protéines mal repliées, à l’organisation des gouttelettes lipidiques et à l’homéostasie métabolique. L’activité de FAF2/ETEA s’entrecroise avec les voies ubiquitine–protéasome et la dynamique des contacts RE–gouttelettes lipidiques, qui influencent la résistance cellulaire au stress. Une régulation altérée de l’ERAD et du métabolisme lipidique a été associée à des états de stress protéotoxique et à des dysfonctionnements métaboliques, faisant de FAF2 un nœud utile pour des études mécanistiques dans ces contextes.

ETEA Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FAF2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ETEA Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FAF2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FAF2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ETEA. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FAF2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ETEA au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ETEA dans les cellules tumorales présentant une expression de FAF2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.