EP3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402485-ACT

PTGER3 kodiert den menschlichen Prostaglandin‑E2‑Rezeptor EP3, einen GPCR, der überwiegend an Gi koppelt, um die Adenylylcyclase zu hemmen und cAMP zu senken; kontextabhängig kann er auch an andere G‑Proteine koppeln, die die MAPK‑Signalübertragung und intrazelluläres Ca2+ modulieren. EP3 ist an der prostaglandinvermittelten Kontrolle von Entzündung, Gefäßtonus, Thrombozytenfunktion, Kontraktilität glatter Muskulatur und neuronaler Signalübertragung beteiligt und integriert Signale von Lipidmediatoren in zelltypspezifische transkriptionelle und metabolische Programme. Über diese Signalwege ist die EP3‑Signalgebung relevant für Modelle der Entzündungsregulation, der kardiovaskulären und thrombotischen Biologie sowie der Neurophysiologie und wird häufig in Kontexten untersucht, in denen das Gleichgewicht der Prostanoidrezeptoren Gewebereaktionen beeinflusst.

EP3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PTGER3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EP3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PTGER3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PTGER3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EP3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PTGER3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EP3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EP3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PTGER3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.