ENX-1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420259-ACT

Das murine Gen **Ezh2** kodiert die Histon-Lysin-Methyltransferase **ENX-1**, die katalytische Untereinheit des **Polycomb-Repressor-Komplexes 2 (PRC2)**, der **H3K27me3** ablagert, um Programme der transkriptionellen Stilllegung aufrechtzuerhalten. ENX-1 reguliert die Chromatinkompaktion, die Festlegung von Zelllinien, den Zellzyklus und die Repression entwicklungsbezogener Regulatoren und ist dabei mit der epigenetischen Kontrolle von Enhancern und Promotoren über verschiedene Differenzierungszustände hinweg verknüpft. Eine fehlregulierte EZH2/PRC2-Aktivität ist breit in der Krebsbiologie, der Aufrechterhaltung von Stammzellen und der Differenzierung von Immunzellen untersucht, wobei veränderte H3K27-Methylierung Genexpressionsnetzwerke neu verdrahten kann. **Ezh2** ist daher ein zentraler Knotenpunkt, um in Mausmodellen die chromatinvermittelte Kontrolle von Proliferation, Schicksalsfestlegung und transkriptioneller Plastizität zu untersuchen.

ENX-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ezh2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ENX-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ezh2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ezh2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ENX-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ezh2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ENX-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ENX-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ezh2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.