ENX-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-417028-ACT

EZH2 kodiert das menschliche Protein ENX-1, die katalytische Untereinheit des Polycomb-Repressorkomplexes 2 (PRC2), der Histon H3 an Lysin 27 trimethyliert (H3K27me3) und so transkriptionell repressives Chromatin etabliert. Über Polycomb-vermittelte Stilllegung reguliert ENX-1 die Festlegung von Zelllinien, die Kontrolle des Zellzyklus und die Aufrechterhaltung der zellulären Identität, indem es die Chromatinzugänglichkeit und weitreichende epigenetische Programme moduliert. Die EZH2-abhängige Repression überschneidet sich mit zentralen Signalwegen, die Proliferation und Differenzierung steuern, einschließlich Chromatin-Remodeling und entwicklungsbezogener Transkriptionsnetzwerke. Eine fehlregulierte EZH2-Aktivität und veränderte H3K27-Methylierungslandschaften sind häufig mit onkogenen Transkriptionszuständen und krankheitsrelevantem epigenetischem Remodeling assoziiert, was EZH2 als Modellgen in der Krebs- und Chromatinbiologieforschung unterstützt.

ENX-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EZH2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ENX-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EZH2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EZH2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ENX-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EZH2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ENX-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ENX-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EZH2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.