ELKS Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404216-ACT

O ERC1 humano codifica a ELKS (também conhecida como proteína de ancoragem da família Rab6-interacting/CAST), um componente central da zona ativa cortical que organiza o ancoramento de vesículas e a exocitose regulada. A ELKS coordena complexos proteicos que acoplam a sinalização de pequenas GTPases a vias do citoesqueleto e do tráfego de membranas, sustentando uma libertação eficiente de neurotransmissores e a fusão de grânulos secretores. Em neurónios e células endócrinas, a ELKS contribui para a organização sináptica, a probabilidade de libertação pré-sináptica e a secreção dependente de estímulo, através de interações com a maquinaria da zona ativa e associada a SNAREs. Alterações na expressão ou na localização de ERC1/ELKS têm sido associadas a desregulação da transmissão sináptica e a fenótipos neurobiológicos mais amplos, apoiando a sua utilização como uma ferramenta molecular em estudos de vias sobre secreção e função de circuitos.

ELKS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ERC1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ELKS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ERC1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ERC1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ELKS. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ERC1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ELKS no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ELKS em células tumorais com expressão de ERC1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.