Eg5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402276-ACT

Humanes Eg5 (KIF11) kodiert einen Kinesin-5-Mikrotubuli-Motor, der während der Mitose die Trennung der Zentrosomen und den Aufbau einer bipolaren Spindel antreibt und so eine korrekte Anordnung (Kongression) und Segregation der Chromosomen sicherstellt. Die Eg5-Funktion ist in die Mikrotubuli-Dynamik und die Kontrolle durch den Spindel-Assembly-Checkpoint eingebunden und koppelt ATP-abhängige Motilität an den ordnungsgemäßen Ablauf des G2/M-Übergangs. Eine fehlregulierte Eg5-Aktivität stört die Spindelintegrität und fördert chromosomale Instabilität und Aneuploidie – Prozesse, die häufig in der Biologie proliferativer Erkrankungen untersucht werden. Als zentraler mitotischer Regulator wird Eg5 широко zur Untersuchung der Zellzykluskontrolle, der Spindelmechanik und von Signalwegen der Genomstabilität eingesetzt.

Eg5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen -Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Eg5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des -Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der -Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Eg5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native -Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Eg5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Eg5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem -Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.