Plásmido CRISPR de Activación (h) EAT-2: sc-403780-ACT

SH2D1B codifica EAT-2, un adaptador que contiene un dominio SH2 y se expresa predominantemente en células hematopoyéticas, que acopla la señalización de los receptores de la familia SLAM —incluidos CD244/2B4 y CD84— con programas efectores inmunitarios aguas abajo. Al unirse a motivos de fosfotirosina en receptores activados y ensamblar complejos de señalización, EAT-2 modula los umbrales de activación de los linfocitos, las respuestas de gránulos citotóxicos y la producción de citocinas, en particular en células NK y en subpoblaciones de células T y de células presentadoras de antígeno. Este adaptador contribuye al control fino de las vías dependientes de ITSM que moldean la formación de la sinapsis inmunitaria y las redes de señalización inflamatoria. La actividad desregulada de SH2D1B/EAT-2 se ha asociado con una vigilancia inmunitaria alterada y fenotipos inflamatorios, lo que la hace relevante para estudios mecanísticos en inmunología y biología del cáncer.

EAT-2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SH2D1B sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

EAT-2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SH2D1B en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SH2D1B, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de EAT-2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SH2D1B y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de EAT-2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía EAT-2 en células tumorales con expresión de SH2D1B silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.